Szolgáltatások

Minta minőségellenőrzés - Bioanalyzer

A microarray analízis elvégzésének kiemelkedően fontos feltétele a vizsgálathoz felhasznált RNS, DNS minta megfelelő minősége. Az Agilent 2100 Bioanalyzer mikrokapilláris chip-gélelektroforézis rendszer alkalmas az izolált nukleinsavak tisztaságának és összetételének vizsgálatára, mely lépés elsősorban a microarray vizsgálat minőségének biztosításához szükséges. Az agaróz gélelektroforézissel analóg művelet 2 nagyságrenddel nagyobb érzékenységgel, automatikus adatgyűjtéssel és feldolgozással, valamint az adatok archiválásával egy rendkívül érzékeny és megbízható ellenőrzési pontnak számít. A készülék elektrokinetikus mikrokapilláris elven, 12/11 minta (Nano/Pico chip) egyidejű befogadására alkalmas chipekkel működik. 1 μl vizsgálandó mintát felhasználva a mérési idő mindössze 30 perc (/12 vagy 11 mintára vonatkoztatva). Az egyes fragmensek mérése az interkalálódott festék fluoreszcens jelének lézer detektálásával történik.

Természetesen a módszer nem csak microarray vizsgálatok esetén használható. Bármilyen olyan esetben érdemes a minták minőségét ellenőrizni, ahol szükséges lehet a minta intaktságának ismerete (pl. biobank, qPCR, WGA, stb.)

Megfelelő minőségű nukleinsav (főként RNS) tisztításához elengedhetetlen a megfelelő izoláló módszer kiválasztása.

Cégünk vállalja totál RNS, miRNS és genomiális DNS izolálását sokféle kiindulási anyagból, akár kisebb mennyiségű mintából, vagy speciálisabb körülményeket igénylő mintákból is (pl. fibrózus szövet, magas zsírtartalmú szövet, stb).

Expressziós microarray

Az elmúlt évtizedek egyik legnagyobb metodikai fejlesztése, a microarray technológia megalkotása révén korábban elképzelhetetlen mennyiségű adat vált elérhetővé, melyek számítógépes elemzése során eddig ismeretlen élettani és patológiás folyamatokra derült fény. A Chromoscience Kft. teljes körű génexpressziós szolgáltatást nyújt a kísérlet tervezésétől, a méréshez felhasznált minta előállításán át egészen a szoftveres adatelemzésig. A mérések az igen megbízható eredménnyel szolgáló, s a világ egyik élvonalbeli microarray rendszer gyártójának számító Agilent Technologies rendszerén történnek.

A génexpressziós microarray egy hibridizáción alapuló, egyszerre több szekvencia párhuzamos vizsgálatára alkalmas rendszer, ami lehetővé teszi akár több ezer gén kifejeződésének egyidejű vizsgálatát. A vizsgálni kívánt génekre specifikus oligonukleotid próbákat szilárd hordozóhoz (pl. üveglemezre) rögzítik, majd az izolált mRNS-ekből készített, fluoreszcens festékkel jelölt cRNS izolátumot a lemezhez hibridizáltatva vizsgálható a gének szöveti kifejeződése. A microarray vizsgálatok kvantitatív eredményt adnak a génexpressziós mintázatra vonatkozóan.

Az Agilent génexpressziós array platform számos előnyős tulajdonsága közül néhányat érdemes kiemelnünk:

  • Nagy specificitást biztosító 60 mer hosszúságú oligonukleotid próbák
  • Magas dinamikus mérési tartomány (>5 logs)
  • Nagyon nagy pontosság, magas fokú korreláció (TaqMan RT-PCR (r>0,9))
  • Reprodukálhatóság (szignál értékek kovarianciája <10%)
  • Teljesen testre szabható tartalom több formátumban (4plex, 8plex) a legrugalmasabb kísérlettervezésért
  • Már csekély mennyiségű kiindulási anyag is elegendő (50 ng teljes RNS)

Az „ink jet” próbanyomtatási technológia egyrészt nagy flexibilitást biztosít, másrészt lehetővé teszi nemcsak a kereskedelmi forgalomban lévő, hanem egyéni igények szerint tervezett, célzott géncsoportokra fókuszáló expressziós microarray mérések kivitelezését is. A SurePrint nyomtatótechnológián alapuló in situ oligo szintézis a microarray összetétel gyors megváltoztatását teszi lehetővé, lépést tartva ezáltal a genetikai tartalom és gének annotálásának folyamatos bővülésével, valamint egyedülálló rugalmasságot jelent a felhasználói array-k legyártásában. A felhasználói array-k tervezésére külön adatbiztonsággal ellátott honlap áll rendelkezésre (Agilent earray), ahol a felhasználó saját magának tervezhet és gyártathat chipet, a fenti minőségi feltételekkel.

Az általunk leggyakrabban használt expressziós microarray formátumok jellemzői:

  • human 4x44K
    • A 4x44K típusú array 4 minta mérését teszi lehetővé egy lemezen
    • A Sure Print technológiával nyomtatott 60mer hosszúságú próbák nagymértékű specificitást biztosítanak
    • 27958 target detektálásának lehetőségét nyújtja az Entrez Gene adatbázis alapján
    • A RefSeq, Ensembl, UniGene, és GenBank adatbázisok alapján összeállított tartalom, mely a teljes human transzkriptomot lefedi
    • Az expressziós méréshez mindig az Agilent aktuálisan legfrissebb array formátumát használjuk
  • egér 4x44K
    • Ez az array formátum 4 minta mérését teszi lehetővé egy lemezen
    • A Sure Print nyomtatótechnológiával gyártott 60 mer hosszúságú próbák nagymértékű specificitást biztosítanak
    • 39430 target detektálásának lehetősége az Entrez Gene adatbázis alapján
    • A RefSeq, Ensembl, RIKEN, UniGene, és GenBank adatbázisok alapján összeállított tartalom, mely a teljes egér transzkriptomot lefedi
    • Az expressziós méréshez mindig az Agilent aktuálisan legfrissebb array formátumát használjuk

Szolgáltatásaink keretében különböző modellorganizmusok expressziós vizsgálatára van lehetőség, például Arabidopsis, Caenorhabditis, Drosophila, Magnaporthe, vagy Xenopus. A további modellorganizmusokhoz kapcsolódó expressziós mérési lehetőségekről kérjük, érdeklődjön elérhetőségeink valamelyikén.

Agilent egy-, illetve kétszínű expressziós mérési opciók:

Az Agilent Dual-Mode Gene Expression Analysis Platform lehetőséget biztosít a kutatóknak, hogy kísérleti tervüket teljes szabadsággal a lehető legmegfelelőbb módon alakítsák ki. Amikor két kísérleti kondíció (kezelt vs. kezeletlen minta) összehasonlítása a cél, a kétszínű opció adja a legegyszerűbben magyarázható és legpontosabb eredményt, mivel itt két különbözőképpen jelölt RNS molekula kohibridizál az array felszínéhez egymással kompetitív módon.

Azonban olyan vizsgálatokban, ahol több kísérleti csoport van, az egyszínű opció a legegyszerűbben magyarázható és legköltséghatékonyabb választás. Mindkét opció kiváló rendszerteljesítményt és felsőfokú minőséget nyújt.

miRNS microarray

Az evolúció során nagyfokú konzerváltságot mutató mikroRNS-ek (miRNS) az élővilágban szinte mindenütt előforduló szabályozó molekulák, melyek nem kódolnak fehérjét, de mRNS kölcsönhatásuk révén fontos szerepet töltenek be a génexpresszió finom szintű (posztranszkripcionális) szabályozásában. Irodalmi adatok támasztják alá jelentőségüket alapvető biológiai funkciók érzékeny beállításában, mint az osztódás, programozott sejthalál, zsíranyagcsere vagy a differenciálódás.

A Chromoscience Kft. a precíz és megbízható Agilent miRNS expressziós rendszert ajánlja vevőinek, mely a következő lehetőségeket nyújtja:

  • miRNS expresszió detektálása a mintában
  • Teljes RNS-ből történő kiindulás, mely eliminálja a miRNS izolálás során fellépő torzításokat
  • Sanger miRBase adatbázis alapján összeállított tartalom
  • Kifinomult próbatervezés és egyedülálló jelölés nyújtotta optimális érzékenység és szelektivitás
  • A legszélesebb dinamikus mérési tartomány (>5 log) biztosítja az alacsonyan és magasan expresszálódott molekulák kimutatását a legrelevánsabb biológiailag adat elérése érdekében
  • Teljesen testre szabható tartalom több formátumban a legrugalmasabb kísérlettervezésért
  • 100 ng teljes RNS elegendő
  • Elérhető humán, egér és patkány fajokban
  • Multiplex-formátum: 8x15K

Az általunk leggyakrabban használt miRNS array formátumok jellemzői:

  • human 8x15K
    • A 8x15K típusú array 8 minta mérését teszi lehetővé egy lemezen
    • A Sure Print technológiával nyomtatott 60 mer hosszúságú próbák nagymértékű specificitást biztosítanak
    • 866 human és 89 human virális miRNS mérhető egyidőben
    • Sanger miRBase alapján összeállított tartalom
    • Az expressziós méréshez mindig az Agilent aktuálisan legfrissebb array formátumát használjuk
  • egér 8x15K
    • A 8x15K típusú array 8 minta mérését teszi lehetővé egy lemezen
    • A Sure Print nyomtatótechnológiával gyártott 60 mer hosszúságú próbák nagymértékű specificitást biztosítanak
    • 627 egér miRNS és 39 egér vírus miRNS mérhető egyidőben
    • Sanger miRBase alapján összeállított tartalom
    • Az expressziós méréshez mindig az Agilent aktuálisan legfrissebb array formátumát használjuk

ChIP-on-chip

A kromatin immunoprecipitációt („ChIP”) és microarray („chip”) technológiát ötvöző ChIP-on-chip módszer segítségével az in vivo körülmények között kialakult DNS-fehérje kölcsönhatások vizsgálhatók. Ezen módszer alkalmas például a DNS-hez kapcsolódó transzkripciós faktorok lokalizációjának és regulációjának monitorozására, csakúgy, mint a DNS javítás és replikáció, a hiszton módosítás vagy a DNS metiláció vizsgálatára.

Az általunk alkalmazott Agilent promoter microarray-k legfontosabb jellemzői:

  • a ChIP-on-chip technológiára validált optimalizált próbákat tartalmaznak, melyeket kifejezetten DNS kötő fehérjék helymeghatározásra terveztek
  • UCSC human genom és UCSC Mus musculus adatbázisok alapján összeállított tartalom
  • A leggyakoribb human és egér microarray formátumokon kívül elérhető más fajokban is (élesztő, fonálféreg, ecetmuslica, zebrahal, Schizosaccharomyces-pombe)
  • A human ENCODE ChIP-on-chip array-ket kifejezetten a kódoló régiókon belüli DNS kötő fehérjék azonosítására fejlesztették ki

Cégünk szolgáltatásai a ChIP-on-chip mérések esetében a DNS jelölésre és hibridizálásra terjednek ki.

aCGH

Az array CGH az egyik legkorszerűbb módszer a kromoszómák kópiaszám, illetve szerkezeti változásainak (transzlokáció, deléció, mikrodeléció, amplifikáció) kimutatására. Ez a microarray alapú technológia integrált rendszerben egyszerre nagyszámú vizsgálat elvégzését teszi lehetővé, mely végül a citogenetikai vizsgálatoknál jóval pontosabb információt szolgáltat az esetleges kromoszóma eltérésekről.

A vizsgálat során felhasznált DNS származhat közvetlenül vérből, amnion folyadékból, chorion villusból, csontvelőből, valamint szövetmintából. Az eljárás gyors, sejtkultúrákat nem igénylő módszer, ennek köszönhetően pontos eredményt kaphatunk akkor is, ha a hagyományos citogenetikai technikák nem egyértelműen értékelhetők. A kísérlet során a vizsgálandó (pl. tumoros szövetből származó) DNS-t egy zölden fluoreszkáló festékkel, míg az ép (kontroll) szövetmintákból származó DNS-t egy másik, pirosan fluoreszkáló festékkel jelöljük és együtt olyan üveglemezre hibridizáljuk, amelyre nagyszámú, ismert szekvenciájú cDNS- vagy genomikus DNS-darabot rögzítettek (DNS-chip, DNA microarray). Lézerszkennerrel végzett leolvasás után a színbeli különbségek számítógép segítségével értékelhetők ki.

Szolgáltatásaink keretében a kutatási célra kifejlesztett Agilent által forgalmazott különböző felbontású teljes genom, illetve a megrendelő igényei alapján tervezett aCGH-kat ajánljuk humán, egér és patkány fajokhoz.

Bizonyos esetekben, egyes biológiai minták vizsgálatához a klinikai fókusszal tervezett nemzetközi standard citogenetikai array-ket (ISCA, International Standard Cytogenetic Array) ajánljuk.

A CytoChip ISCA array-ket kifejezetten a szervi rendellenességek vizsgálatára tervezték, azáltal, hogy az oligonukleotid próbák számát megnövelték az ismert szervi rendellenességekkel asszociált génrégiókban.

Amikor a vizsgálandó minta mennyisége és/vagy minősége nem teszi lehetővé a hagyományos citogenetikai tesztek (FISH és G-sávos kariotipizálás), valamint arrayCGH mérések kivitelezését, a Cytochip Focus array család az ideális választás az analízishez. A Cytochip Focus jól bevált ultra érzékeny BAC array, mely lehetőség ad nagyobb kromoszóma szerkezeti változások detektálására klonális sejtpopulációk esetében is. Megbízható eredménnyel szolgál akár 50 ng gyenge minőségű DNS-ből, kiküszöbölve ezzel a sejttenyésztést és a teljes genom amplifikálást. Így elkerülhetőek a sejttenyésztési procedúra során létrejövő esetleges mesterséges kromoszómahibák, melyek gyakran előfordulnak hematológiai mintákban, elfedve ezzel a valós biológiai állapotot.

A CytoChip Cancer array-t úgy tervezték, hogy a próbák exon-fókuszáltan, nagy sűrűségben helyezkednek el egyes betegség régiókban. Minden CytoChip Cancer array 20.000 betegség kapcsolt oligo próbát tartalmaz, 670 tumor gént fedve le ezáltal, beleértve azokat is, amelyek jellemzően tumorokban amplifikálódnak vagy deletálódnak.

Q-PCR

Kvantitatív (valós idejű) Polimeráz Lánc Reakció

Az expressziós és miRNS microarray vizsgálatok talán legbonyolultabb része a kapott adatok feldolgozása, interpretálása és az eredmények validálása. A megrendelő igényei alapján vállaljuk a kísérleti eredmények (mRNS, miRNS) kvantitatív Polimeráz Lánc Reakcióval (q-PCR) történő ellenőrzését.

A módszer alapja a hagyományos PCR reakció, legfőbb tulajdonsága azonban, hogy a felsokszorozott DNS/cDNS mennyiségi analízise a reakció közben valós időben történik. A termék detektálására kétféle eljárás terjedt el:

  • nem specifikus fluoreszcens festékek alkalmazása: bármilyen kettős szálú DNS molekulába képesek interkalálódni
  • szekvencia specifikus DNS próbák használata: ezek fluoreszcensen jelölt oligonukleotidokból épülnek fel, melyek jele csak a próba komplementer szekvenciával történő hibridizálása után válik detektálhatóvá.

Laborunkban mindkét módszer elérhető és igény esetén a reakcióban használt szekvencia specifikus primerek kiválasztásában, illetve tervezésében is segítséget nyújtunk.